மரபணு பொறியியலில் முன்னேற்றங்கள்
திறந்த அணுகல்
ஐ.எஸ்.எஸ்.என்: 2169-0111
ஐ.எஸ்.எஸ்.என்: 2169-0111
Pouiré Yaméogo
பெரும்பாலான ஃபிரெட்ரிக் அட்டாக்ஸியா வழக்குகள் ஃபிராடாக்சின் மரபணுவின் முதல் இன்ட்ரானில் ஜிஏஏ ரிப்பீட் சீக்வென்ஸ் (ஜிஏஆர்) செருகப்படுவதால் புரத வெளிப்பாடு குறைவதற்கு வழிவகுக்கிறது. CRISPR-Cas9 தொழில்நுட்பத்தால் இந்த GAAr ஐ நீக்குவது ஃப்ராடாக்சின் வெளிப்பாடு அதிகரிப்பதற்கு வழிவகுக்கிறது. AAV பேக்கேஜிங்கின் வரையறுக்கப்பட்ட அளவு காரணமாக, SpCas9 ஆல் GAAr அகற்றுவதற்கு இரண்டு Adeno-தொடர்புடைய வைரஸ்கள் (AAVகள்) தேவைப்பட்டன. 2 AAVகளைப் பயன்படுத்துவது சாத்தியமான சிகிச்சையின் செயல்திறனைக் குறைக்கிறது, ஏனெனில் ஒவ்வொரு உயிரணுவும் இரண்டு வைரஸ்களாலும் பாதிக்கப்பட வேண்டும். எனவே நாங்கள் CjCas9 ஐப் பயன்படுத்தியுள்ளோம், ஏனெனில் இது ஒரு AAV மூலம் இரண்டு sgRNAகளுடன் வழங்கக்கூடிய அளவுக்கு சிறியது. எவ்வாறாயினும், விவோவில் AAV வழங்கிய CjCas9 மரபணுவின் அமைப்புரீதியான வெளிப்பாடு இலக்கு மாற்றங்களை அதிகரிக்கலாம் மற்றும் Cas9 புரதத்திற்கு எதிராக நோய் எதிர்ப்பு சக்தியைத் தூண்டலாம். CRISPR அமைப்புக்கு தற்காலிக வெளிப்பாடு முக்கியமானது. நியூக்லீஸ் வெளிப்பாட்டைக் கட்டுப்படுத்த இரண்டு அணுகுமுறைகளை நாங்கள் ஆராய்ந்தோம்.
முதலில், மூலக்கூறு ஹரா கிரி, ஒரே நேரத்தில் ஹெலா செல்கள் பிளாஸ்மிட்கள் என்கோடிங் CjCas9, இரண்டு வழிகாட்டிகள் (முன் மற்றும் பிந்தைய GAAr) frataxin மரபணுவை குறிவைத்து மற்றும் CjCas9 மரபணுவை குறிவைக்கும் இரண்டு வழிகாட்டிகள். CjCas9 மரபணுவின் சுய-அழிவு இருந்தபோதிலும், FXN மரபணுவின் பயனுள்ள மரபணு எடிட்டிங் விட்ரோவில் பெறப்பட்டது என்பதை எங்கள் முடிவுகள் காட்டுகின்றன.
இரண்டாவதாக, CRISPR-SCRET (ஸ்டாப் கோடான் ரீட் த்ரூ), அதன் வெளிப்பாட்டை அடக்குவதற்கு CjCas9 மரபணுவின் தொடக்கத்தில் ஒரு ஸ்டாப் கோடானை (TGA) செருகினோம். பின்னர், முன்கூட்டிய நிறுத்தக் கோடான் இருந்தபோதிலும் மொழிபெயர்ப்பை அனுமதிக்கும் திறன் கொண்ட மூலக்கூறுகளால் Cas9 இன் வெளிப்பாட்டைத் தூண்டினோம். இந்த பிளாஸ்மிட் இரண்டு sgRNAகளுடன் (GAArக்கு முந்தைய மற்றும் பிந்தைய) 293T கலங்களுக்கு மாற்றப்பட்டது. G418 உடன் சிகிச்சையளிக்கப்பட்ட கலங்களில் மட்டுமே GAAr ஐ நீக்குவதை நாங்கள் குறிப்பிட்டோம்.
இந்த வெவ்வேறு முறைகள் நிலையான Cas9 வெளிப்பாட்டைத் தடுக்கும் அதே வேளையில் ஃப்ராடாக்சின் மரபணுவின் திறமையான திருத்தத்தைப் பெற அனுமதிக்கப்படுகிறது. இது காஸ்9 புரதத்திற்கு எதிரான இலக்கு மாறுபாடுகள் மற்றும் நோயெதிர்ப்பு எதிர்வினைக்கான வாய்ப்புகளை குறைக்கலாம்.